PRACTICA 7 (incluye parte 1 y 2 )

 PARTE 1: CUANTIFICACIÓN DE HbA2 POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IONICO.                                                                                                         

FECHA 14/12/2021

OBJETIVO

Determinar el porcentaje de hemoglobina A2 respecto de la hemoglobina total, utilizando una micro columna de intercambio iónico para su separación.

FUNDAMENTO

Después de preparar un hemolizado, las hemoglobinas son retenidas por una resina de intercambio aniónico. La hemoglobina A2 (HbA2) se eluye de forma específica bajo estrictas condiciones de pH y fuerza iónica, cuantificándose por lectura fotométrica a 415 nm.


MATERIAL

  • Micropipetas
  • 4 tubos de ensayo.
  • puntas de micropipetas.
  • gradilla
  • para film.
  • pipeta graduado de 10 ml.
  • vaso de precipitados.
  • columna( contienen la resina de intercambio iónico.)
  • micro cubetas.
REACTIVOS
  • lejía.
  • Sangre.
  • hemolizado
  • agua destilada.
EQUIPOS

  • Espectrofotómetro.


PROCEDIMIENTO

Preparación del hemolizado

1. Pipetear en un tubo de ensayo:

Sangre: 50 µL

Agua destilada: 200 µL

Agitar. Este hemolizado se utilizará en los pasos 3 y 7.

2. Destapar la parte superior de la Microcolumna, romper a continuación la lengüeta inferior y bajar el disco superior hasta el nivel de la resina, evitando comprimirla, con la ayuda del extremo plano de una pipeta. Dejar gotear hasta que el líquido alcance el nivel del disco, desechando el eluído.

3. Aplicar cuidadosamente sobre el disco superior:

Hemolizado: 50 µL --> Desechar el eluído

4. Cuando haya penetrado todo el hemolizado añadir, procurando arrastrar los posibles restos del mismo:

Reactivo 200 µL --> Desechar el eluído

5. Colocar la microcolumna sobre un tubo de ensayo y añadir:

Reactivo 3,0 mL --> Recoger el eluído (Fracción HbA2)

6. Agitar bien y leer la absorbancia (A) de la fracción HbA2 a 415 nm frente a agua destilada

(AHbA2). La absorbancia es estable al menos durante seis horas.7.Pipetear en un tubo de ensayo.12 ml de agua destilada y 50µL de Hemolizado.8.leer absorbancia a 415 nm frente a agua destilada ( Ahb total)


RESULTADOS

ABSORBANCIA DE HBA2 = 0.040.
ABSORBANCIA DE Hb total = 0.567


(A(0.040)* 3 ml ) /  (A(0.0567) *12 ml)  * 100 
= 1.76% HbA2 

El valor esta dentro del intervalo de referencia de normalidad 1.3 -3.7%




imágenes tomadas durante la practica.


PARTE 2: DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE HIERRO EN PLASMA 

OBJETIVO:

Determinar de forma cuantitativa la cantidad de hierro presente en la muestra.

FUNDAMENTO

El hierro es el constituyente de un gran número de enzimas. La mioglobina, proteína muscular, contiene hierro, así como el hígado.
El hierro es necesario para la producción de hemoglobina, molécula que transporta el oxígeno en el interior de los glóbulos rojos. Su déficit causa anemia ferropénica. Se encuentran niveles elevados de hierro en la hemocromatosis, cirrosis, hepatitis aguda y en concentraciones altas de transferrina. La variación día a día es común en poblaciones sanas.
Estabilidad: 3 meses a 2-8ºC o 1 mes a temperatura ambiente (15-25ºC).
El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

El hierro se disocia del complejo sérico hierro-transferrina en medio ácido débil. El hierro libre se reduce a ión ferroso mediante el ácido ascórbico. Los iones ferrosos en presencia de FerroZine forma un complejo coloreado:

La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hierro en la muestra ensayada.

MATERIAL

*Gradilla.
*4 cubetas
*micropipetas.
*puntas de pipetas

REACTIVOS
                   

EQUIPO


*Centrifugadora .
*Espectrofotometro.

PROCEDIMIENTO.

1. Condiciones del ensayo: 
Longitud de onda:562nm (530-590) 
Cubeta: 1cm paso de luz 
Temperatura: 37ºC / 15- 25ºC
2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.
3. Pipetear en una cubeta:


4. Mezclar e incubar 5 min a 37ºC o 10 min a temperatura ambiente.
5. Leer las absorbancias (A) del Patrón y la muestra frente al Blanco de reactivo. El color es estable como mínimo 30 minutos.




Imagen tomada durante la práctica.

RESULTADO:
((A) Muestra - (A) Blanco de muestra - (A) Blanco de reactivo / (A) Patrón - (A) Blanco de reactivo) x 100 (Concentración Patrón)

(A) Patrón: 0,088
(A) Muestra: 0.070
(A) Blanco muestra :0.034
(A) Blanco de reactivo :0.001


(0.070-0.034-0.001) / (0.088-0.001 ) *100 = 40.90




OBSERVACIONES

Por el resultado es una mujer y esta dentro de los valores de normalidad , aunque esta al limite de tener anemia

Valor de referencia mujer: 40-150 μg/dL 

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